一、光學(xué)顯微鏡及其性能限制
    人們用肉眼觀察細(xì)小物體所能看見的最小細(xì)節(jié)即人眼分辨率（resolving power）約0.2mm。17世紀(jì)光學(xué)顯微鏡(light microscope)的出現(xiàn)，打開了微觀世界的大門，把人類的視野向微觀世界深入了3個數(shù)量級(分辨率提高到0.2μm)， 看到了許多肉眼看不到的微小物體，如細(xì)胞、細(xì)菌和其他一些微生物。人類醫(yī)學(xué)對自身的研究也隨之從解剖學(xué)的領(lǐng)域深入到組織及細(xì)胞學(xué)的水平。
    光學(xué)顯微鏡可以簡單地理解為兩塊透鏡的組合，由于映入人眼的物像的放大率是這兩塊透鏡放大率之積，似乎如此，若想進(jìn)一步提高放大率，只要增加透鏡的屈光度就行了，然而隨著放大率的增加，首先便遇到透鏡像差這個障礙。所謂透鏡像差，即透鏡本身存在的缺陷，它使所成的影像產(chǎn)生畸變、彎曲或其他像質(zhì)下降現(xiàn)象。當(dāng)放大率增加時，透鏡的這些缺陷也隨之?dāng)U大，物像也就變得模糊起來，這就失去了增加放大率的意義。要想完消除透鏡的像差是做不到的，不過，現(xiàn)代光學(xué)透鏡制作的技術(shù)水平可使像差保持在一個很小的數(shù)值內(nèi)，從而使光鏡可達(dá)到1000多倍的放大率，這也是光鏡放大本領(lǐng)的極限。光鏡的性能為什么會有這樣一個難以超越的界限呢? 決定這個界限的因素是什么? 原來最主要的問題不在于顯微鏡本身，而是取決于作為成像媒介的光線性質(zhì)。因?yàn)楣獯嬖谥苌湫?yīng)，光鏡下看不清直徑小于可見光波長一半的物體。
    二、電鏡的誕生和發(fā)展
    圖4-1電磁波的傳遞過程 

圖4-1 電磁波的傳遞過程

    1923年，法國科學(xué)家Louis de Broglie發(fā)現(xiàn)，微觀粒子本身除具有粒子特性以外還具有波動性。他指出不僅光具有波粒二象性，一切電磁波和微觀運(yùn)動物質(zhì)(電子、質(zhì)子等)也都具有波粒二象性。電磁波在空間的傳播如圖4-1所示，是一個電場與磁場交替轉(zhuǎn)換向前傳遞的過程。電子在高速運(yùn)動時，其波長遠(yuǎn)比光波要短得多，于是人們就想到是不是可以用電子束代替光波來實(shí)現(xiàn)成像?
    1926年，德國物理學(xué)家H·Busch提出了關(guān)于電子在磁場中的運(yùn)動理論。他指出：具有軸對稱性的磁場對電子束來說起著透鏡的作用。從理論上設(shè)想了可利用磁場作為電子透鏡，達(dá)到使電子束會聚或發(fā)散的目的。
    有了上述兩方面的理論，1932年，德國柏林工科大學(xué)高壓實(shí)驗(yàn)室的M.Knoll和E.Ruska研制成功了第1臺實(shí)驗(yàn)室電子顯微鏡，這是后來透射式電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）的雛形。其加速電壓為70kV，放大率僅12倍。盡管這樣的放大率還微不足道，但它有力地證明了使用電子束和電磁透鏡可形成與光學(xué)影像相似的電子影像。這為以后電子顯微鏡的制造研究和提高奠定了基礎(chǔ)。
    1933年，E.Ruska用電鏡獲得了金箔和纖維的1萬倍的放大像。至此，電鏡的放大率已超過了光鏡，但是對顯微鏡有著決定意義的分辨率，這時還只剛剛達(dá)到光鏡的水平。1937 年，柏林工業(yè)大學(xué)的Klaus和Mill繼承了Ruska的工作，拍出了第1張細(xì)菌和膠體的照片，獲得了25nm的分辨率，從而使電鏡完成了超越光鏡性能的這一豐功偉績。
    1939年，E.Ruska在德國的Siemens公同制成了分辨率優(yōu)于10nm的第1臺商品電鏡。由于E·Ruska在電子光學(xué)和設(shè)計第1臺透射電鏡方面的開拓性工作被譽(yù)為“本世紀(jì)最重要的發(fā)現(xiàn)之一”，而榮獲1986年諾貝爾物理學(xué)獎。
    除Knoll、Ruska以外，同時其他一些實(shí)驗(yàn)室和公司也在研制電鏡。如荷蘭的菲利浦（Philip）公司、美國的無線電公司(RCA)、日本的日立公司等。1944年P(guān)hilip公司設(shè)計了150kV的透射電鏡，并首次引入中間鏡。1947年法國設(shè)計出400kV的高壓電鏡。60年代初，法國制造出1500kV的超高壓電鏡。1970年法國、日本又分別制成3000kV的超高壓電鏡。
    進(jìn)入60年代以來，隨著電子技術(shù)的發(fā)展，特別是計算機(jī)科學(xué)的發(fā)展，透射電鏡的性能和自動化程度有了很大提高?，F(xiàn)代透射電鏡（如日立公司的H-9000型）的晶格分辨率最高已達(dá)0.1nm，放大率達(dá)150萬倍。人們借助于電鏡不但能看到細(xì)胞內(nèi)部的結(jié)構(gòu)，還能觀察生物大分子和原子的結(jié)構(gòu)，應(yīng)用也愈加廣泛和深入。
    掃描電鏡(scanning electron microscope, SEM)作為商品出現(xiàn)則較晚，早在1935年，Kn oll在設(shè)計透射電鏡的同時，就提出了掃描電鏡的原理及設(shè)計思想。1940年英國劍橋大學(xué)首次試制成功掃描電鏡。但由于分辨率很差、照相時間過長,因此沒有立即進(jìn)入實(shí)用階段， 至1965年英國劍橋科學(xué)儀器有限公司開始生產(chǎn)商品掃描電鏡。80年代后掃描電鏡的制造技術(shù)和成像性能提高很快，目前高分辨型掃描電鏡（如日立公司的S-5000型）使用冷場發(fā)射電子槍，分辨率已達(dá)0.6nm，放大率達(dá)80萬倍。
    我國從50年代初開始研制透射電鏡，1959年第1臺透射電鏡誕生于上海新躍儀表廠，此后中型透射電鏡開始批量生產(chǎn)。目前國產(chǎn)透射電鏡分辨率已達(dá)0.2nm，放大80萬倍。掃描電鏡也于70年代開始生產(chǎn)。國內(nèi)主要生產(chǎn)電鏡的廠家是:北京中科院科學(xué)儀器廠、上海新躍儀表廠、南京江南光學(xué)儀器廠等。
    三、電鏡和光鏡的比較
    光鏡和電鏡不僅在體積大小、價格高低、使用條件等方面不同，而且在工作原理、儀器結(jié)構(gòu)和性能方面也存在著很大差異。下面僅就主要方面進(jìn)行比較。
    1.成像原理
    光鏡是利用可見光透過標(biāo)本成像于視網(wǎng)膜或膠片上，由于染色方法的不同，可獲得不同顏色的彩色影像；電鏡是利用“單色”電子束成像于熒光屏或膠片上,獲得的是標(biāo)本的密度像��黑白影像.
    2.透鏡自身本質(zhì)的差別
    光學(xué)透鏡是由玻璃制成；而電子透鏡不是肉眼可見的透鏡，它是由磁或電所形成的磁場或電場的局部空間來起到透鏡的作用。
    3.色差控制
    光學(xué)顯微鏡由于利用了各色波長混合而成的自然光，為此必須使用能消除由各色波長引起焦距變化的“消色差透鏡”；而電子透鏡本身則不承擔(dān)消除色差的任務(wù)，而是通過精密地穩(wěn)定加速電壓、提高電子束的“單色性”，來解決電鏡中的色 差問題。
    4.照明源
    光鏡的照明源是可見光，包括自然光、燈光；電鏡的照明源是由陰極產(chǎn)生的高速運(yùn)動的電子束。
    5.光路
    電鏡鏡筒內(nèi)部必須保持高真空，因此電鏡具有復(fù)雜的真空系統(tǒng)；而光鏡則無真空的要求。
    6.分辨率和放大倍數(shù)
    光鏡最高分辨率是0.2μm，放大1000倍左右；而 電鏡分辨率可達(dá)0.2nm，放大率達(dá)100萬倍以上。
    7. 性能特點(diǎn)
    現(xiàn)將光鏡和電鏡的性能特點(diǎn)列表作一對比，見表4-1。
表4-1光鏡和電鏡的性能特點(diǎn)比較

四、電鏡的類型及特點(diǎn) 
    電鏡一般是由鏡體(電磁透鏡系統(tǒng))和相應(yīng)的輔助系統(tǒng)構(gòu)成。出于對鏡體的機(jī)械穩(wěn)定性、重力和其他外界因素影響的考慮，通常是將鏡筒采用直立的方式裝配。由處于頂部的電子槍發(fā)射“光源”（電子束），下方配置適當(dāng)?shù)碾姶磐哥R，按電鏡的類型和工作方式的不同，安排不同性能的電磁透鏡予以適當(dāng)?shù)钠ヅ?，通常電鏡大致可分為3種類型 ：透射式電鏡（TEM）、掃描式電鏡（SEM）和掃描透射式電鏡（STEM）。
    1.透射式電鏡（TEM）
    透射電鏡是靠穿透樣品的電子束進(jìn)行成像放大的，樣品內(nèi)部的結(jié)構(gòu)是通過空間密度不同反映出來的，密度大的地方阻擋和吸收的電子多，透過電子少；結(jié)構(gòu)稀疏處密度小，透過電子多。這樣在透射電子束的橫截面上電子密度的疏與密的分布便對應(yīng)了樣品結(jié)構(gòu)密度的密與疏的關(guān)系，也就是說，透過電子束的密度變化也包含了樣品結(jié)構(gòu)的信息，見圖4-2（a）。 透射式電鏡研制最早，使用最為廣泛。具有以下幾個特點(diǎn)：①成像分辨率最高，現(xiàn)在研制的TEM 已達(dá)到0.1nm；②對樣品厚度有一定要求，通常在30～50nm左右。太厚則電子束不易穿透 ,無法滿足觀察和拍攝時對亮度的要求，且樣品結(jié)構(gòu)重疊過多，會影響影像清晰度；樣品太薄則影響對電子束照射轟擊的耐受性，造成熱損傷和污染；③放大率的范圍相對來說較窄，由于透射工作方式的特點(diǎn)，一般不能從高倍率連續(xù)變化到很低的倍率，通常在幾百倍以下放大時必須更換透鏡的工作方式（由儀器自動切換）。
 

圖4-2 2種基本類型的電鏡

    2.掃描式電鏡(SEM)
    掃描電鏡是把電子束會聚成很細(xì)的束點(diǎn)，稱為電子探針(實(shí)際上要遠(yuǎn)比針尖更為尖細(xì)得多)，象寫字一樣逐行逐點(diǎn)地在樣品表面掃描，然后把激發(fā)出來的二次電子收集起來，將二次電子所攜帶的樣品表面的信息處理成影像，在顯示器上顯現(xiàn)出來，成像的方式是間接的，見圖4-2（b）。SEM的使用相當(dāng)廣泛，研制工藝也比較成熟。特點(diǎn)如下：①由于電子探針沒有穿過樣品內(nèi)部，只在表面激發(fā)出二次電子， 所以主要被用來觀察樣品表面或斷裂面的結(jié)構(gòu)形態(tài)；②景深比TEM長，富有立體感；③放大率范圍寬，可以從幾十倍連續(xù)變化到幾十萬倍；④對樣品制作要求簡單，適應(yīng)性強(qiáng)；甚至有些硬質(zhì)干燥的樣品幾乎可以不用處理而直接觀察；⑤由于電子探針不停地做掃描運(yùn)動，不會長久地對樣品上所有點(diǎn)同時轟擊，所以對樣品的損傷遠(yuǎn)比TEM小得多；⑥樣品室活動范圍大，對樣品的大小、高度和形態(tài)的適應(yīng)性強(qiáng)；TEM樣品通常只能裝載在直徑3mm左右的銅網(wǎng)上，而SEM的樣品室甚至可以容載下直徑 10cm的樣品；⑦分辨率低于同檔次的TEM。
    3.掃描透射式電鏡(STEM)
    掃描透射式電鏡（scanning-transmission  electron microscope，STEM）也是利用電子探針在樣品表面做掃描運(yùn)動，但不接收二次電子，而是在樣品另一面接收透過樣品的透射電子，然后加以處理，顯示出影像。最終像同SEM 一樣顯現(xiàn)在顯像管的熒光屏上。特點(diǎn)為：①成像較好，分辨本領(lǐng)介于TEM和SEM之間；②與SEM一樣，對樣品的損傷??；③要求樣品較薄，以易于穿透；④能將透射電子中的彈性散射電子與損失了一定能量的非彈性散射電子區(qū)別，加以對比分析處理，得到TEM和SEM檢測不到的信息；⑤尤其便于與SEM結(jié)合做同一部位的觀察對比。
    TEM和SEM是電子顯微鏡的2種最基本類型，應(yīng)用較為普及。STEM的使用尚不是十分廣泛，這種觀察方式目前只在分析型電鏡中使用，所謂分析型電鏡即非單一的TEM，也非單一的SEM，是指綜合了各種電鏡的性能，能對多種電子信號進(jìn)行綜合分析處理的電子顯微鏡。
    五、電鏡的工作條件
    1.對電源的要求
    無論哪類電鏡，其根本能源來自于電。電鏡屬于較大型的耗能裝置(若干千瓦以上)。電鏡的啟動在小型電網(wǎng)中會引起電壓的波動，而電網(wǎng)中電壓的波動會對電鏡的使用帶來很不利的影響。越是高性能的電鏡，對電源電壓的要求越高。電源不穩(wěn)定會波及到電鏡內(nèi)部元件工作狀態(tài)，影響電鏡的分辨本領(lǐng)和操作性能。所以電鏡的安裝，必須選擇負(fù)載能力強(qiáng)的電網(wǎng)，另外給電鏡配置電子穩(wěn)壓器也是相應(yīng)的措施之一。但是附近大型用電設(shè)備或含較大電感的用電設(shè)備，在啟閉瞬間所產(chǎn)生的“浪涌電壓”仍是電子穩(wěn)壓器所難以克服的。所以電鏡的安裝最好選用獨(dú)立的供電線路，同時電鏡還必須有良好的接地裝置。地線對于電鏡自身的電磁屏蔽和對操作者的安全都是至關(guān)重要的。
    2.供水要求
    電鏡內(nèi)部產(chǎn)熱元部件較多，如擴(kuò)散泵電爐、電磁透鏡、大功率半導(dǎo)體器件等。所以電鏡工作時要進(jìn)行冷卻，通常都采用水冷方式來降溫，為保證充分的熱交換，要求水壓和流量要足夠大，一般要達(dá)到4～5L/min以上的流量，0.5～2kg/cm2的壓力。同時對水溫也有一定要求(10～25℃之間)，太高對電鏡冷卻不夠充分，太低則可能在冷水通道外壁造成水蒸汽的凝結(jié)，除對電鏡的電氣性能帶來影響外，還可能引起銹蝕。冷卻水的水質(zhì)一定要軟，電鏡冷水通道“盤根錯節(jié)”，管口細(xì)且接頭多，過硬水質(zhì)易在管道中結(jié)垢，清除起來十分困難。最好采用循環(huán)水裝置對電鏡進(jìn)行降溫冷卻，該裝置既能使電鏡內(nèi)流出的水降溫，又能重復(fù)使用蒸餾水，同時達(dá)到避免結(jié)垢、節(jié)約用水的目的。
   六、電鏡的工作環(huán)境
    1.防震
    電鏡是一種高倍率放大的儀器，通常在幾萬到幾十萬倍的放大率下工作，任何因?yàn)檎饎铀鸬募?xì)微變化，都可能通過高倍放大后顯著地表現(xiàn)出來，其結(jié)果必然影響成像，導(dǎo)致分辨力的下降。尤其在拍攝超高分辨影像時，即使有人在旁邊走動，都可能帶來不良影響。所以電鏡的制造者常常在設(shè)計時并不讓電鏡的鏡體直接著地,而是在四角安裝彈簧墊腳，以起到減震作用。而電鏡的使用者在建造電鏡室時又常將鏡體安放處建成獨(dú)立、堅固的地基，盡可能將由外界震動帶來的影響減弱到最小程度。
    2.防磁
    電鏡的成像放大過程是通過磁場對電子束折射來實(shí)現(xiàn)的，然而有用磁場的強(qiáng)度和方向則是經(jīng)過精密設(shè)計的，任何外界電磁場都會起到干擾作用，也是應(yīng)當(dāng)竭力避免的。在我們周圍，無論何處總是或多或少地分布著一些雜亂電磁場。電鏡要求雜亂磁場的分布強(qiáng)度小于5×10-7T（特斯拉），因此最好在電鏡工作室的四周裝嵌金屬屏蔽網(wǎng)。
    3.防塵
    這是任何精密儀器所要求的必需措施，電鏡是機(jī)械與真空、電磁與電子線路的聯(lián)合體，鏡體內(nèi)部要保持高度真空，外部電路要保證高穩(wěn)定、高可靠性，對防塵的要求更不例外。
    4.恒溫恒濕
    溫度的變化會影響電路的穩(wěn)定性以及機(jī)械部件吻合的嚴(yán)密性。濕度太大則不利于電氣元件的絕緣性能，尤其對于帶有上百千伏的高壓元件，潮濕空氣更具有危害性；濕度太低則易在絕緣部件上積聚高壓電荷，產(chǎn)生靜電。電鏡工作室必須裝備空調(diào)機(jī)和去濕機(jī)，使溫度保持在15～25℃之間，濕度控制在70％以下。
    七、觀察電鏡的前后期工作
    1.嚴(yán)格的樣品制作要求
    無論哪一種電鏡樣品制作方法，都應(yīng)具備嚴(yán)格的工藝條件和良好的技術(shù)水平。這是一項必須有細(xì)心、耐心，容不得一絲馬虎的工作，沒有好的樣品，就拍不出好照片，再好的電鏡設(shè)備，再高的操作技術(shù)也是枉然。
    2.精細(xì)的后期暗室處理
    電鏡的成像結(jié)果全部記錄在感光膠片上，后期對結(jié)果的分析也依賴于電鏡底片,所以電鏡底片的沖洗印放等暗室工作也是十分重要的一個環(huán)節(jié)。暗室處理得好，可為電鏡照片增輝，甚至能彌補(bǔ)拍攝過程中的某些不足；處理不好，則不能充分反映出電鏡成像的最佳質(zhì)量，嚴(yán)重的失誤將造成前功盡棄及無可挽回的損失。故而配合電鏡工作應(yīng)當(dāng)置備一個條件好的暗室，輔以精湛的暗室工作技術(shù)，高度重視每一個操作步驟。
    八、電鏡成像技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用
    在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)，電鏡成像技術(shù)已滲入到各個學(xué)科，應(yīng)用日益廣泛。電鏡技術(shù)不僅是醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)形態(tài)學(xué)科研究中不可或缺的工具，而且為臨床疾病的病理研究和診斷提供了更為寬廣和深入的應(yīng)用領(lǐng)域，這里僅舉幾例略作簡單介紹。
    1.在細(xì)胞和分子生物學(xué)方面的應(yīng)用
    電鏡技術(shù)大大推動了細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展，把細(xì)胞學(xué)的研究更進(jìn)一步提高到超微結(jié)構(gòu)的水平。例如，對光鏡下已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞器如線粒體、中心體的結(jié)構(gòu)和功能，在電鏡下有了新的和更深入的了解；對光鏡下爭論不休的高爾基器，在電鏡下得到了證實(shí)并作了深入的研究；在電鏡下發(fā)現(xiàn)了許多新的細(xì)胞器和結(jié)構(gòu)，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)微體，微管、微絲等。此外，電鏡技術(shù)還對細(xì)胞的膜系統(tǒng)、細(xì)胞骨架和細(xì)胞連接的研究起著重要作用。近年來，采用多種電鏡技術(shù)相結(jié) ，使人們能夠?qū)?xì)胞各部分的結(jié)構(gòu)、代謝和功能聯(lián)系起來，進(jìn)行動態(tài)的研究，從而極大地豐富了細(xì)胞生物學(xué)的內(nèi)容。
    電鏡技術(shù)對分子生物學(xué)的研究也作了很大的貢獻(xiàn)。例如，電鏡對染色質(zhì)和染色體的研究為分子遺傳學(xué)提供了大量的形態(tài)依據(jù)；對核糖體的研究使蛋白質(zhì)合成機(jī)制得到了較好的闡 明，對生物大分子的研究促進(jìn)了遺傳工程學(xué)科的發(fā)展等。
    2.在組織學(xué)中的應(yīng)用
    電鏡技術(shù)大大豐富了組織學(xué)的內(nèi)容。例如，對于肌組織，電鏡下揭示了肌細(xì)胞內(nèi)粗絲和細(xì)絲的排列和結(jié)構(gòu)，為闡明肌肉收縮的機(jī)理提供了形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)；對于神經(jīng)組織，通過對突觸超微結(jié)構(gòu)的研究，使人們對神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能有了進(jìn)一步了解；對于循環(huán)系統(tǒng)，透射電鏡不僅能觀察各種毛細(xì)血管的微細(xì)結(jié)構(gòu)，而且掃描電鏡的血管鑄型技術(shù)還能研究毛細(xì)血管在各種組織和器官中的空間分布?？傊婄R技術(shù)已成為組織學(xué)研究中最重要的工具之一。
    3.在微生物學(xué)中的應(yīng)用
    主要包括兩個方面，一是對光鏡下看得見的原蟲、真菌、細(xì)菌等作進(jìn)一步的超微結(jié)構(gòu)研究；二是電鏡技術(shù)對病毒學(xué)的發(fā)展起著重要的作用，如：① 發(fā)現(xiàn)和鑒定新的病毒；②研究病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)和在細(xì)胞內(nèi)形態(tài)發(fā)育過程；③臨床病毒性疾病的診斷，運(yùn)用負(fù)染色技術(shù)和免疫電鏡技術(shù)，可以協(xié)助病毒感染性疾病的診斷，如對天花、水痘、單純皰疹痘泡液的檢查；對一些很難進(jìn)行組織培養(yǎng)的病毒（如肝炎病毒、輪狀病毒）和不引起細(xì)胞明顯病變的病毒（風(fēng) 疹，鼻病毒），電鏡往往是鑒定和診斷的可靠手段。
    4.在病理研究及臨床診斷方面的應(yīng)用
    電鏡技術(shù)推動了超微結(jié)構(gòu)病理學(xué)和診斷學(xué)的進(jìn)展，比較突出的如： ①血液病研究。血細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)研究已為貧血性疾病、血小板疾病、各種白血病的鑒別診斷提供了大量資料；②腫瘤研究，電鏡技術(shù)可為腫瘤的診斷和病因研究提供資料, 對其他影像設(shè)備和光鏡下不易確定的某些腫瘤，有時只有通過超微結(jié)構(gòu)觀察才能解決； ③腎病的研究。由于各種腎病的超微結(jié)構(gòu)病變各具特點(diǎn)，腎活檢標(biāo)本的電鏡觀察有助于早期診斷。如根據(jù)腎小球基底膜的改變，結(jié)合其他超微結(jié)構(gòu)病變將腎小球疾病進(jìn)行新的分類，根據(jù)各種病變的特征可鑒別硬化性腎炎，先天性腎炎和抗原抗體復(fù)合物造成的免疫性腎病等； ④其他疾病的研究。如對肝臟、胃、腸、氣管、皮膚、肌肉等疾病開展超微結(jié)構(gòu)病理活檢工作，獲得了很多有價值的資料，對于疾病的診斷，特別是腫瘤的診斷很有意義。