熒光顯微鏡是一種用于可視化

在這個指導中，我將回顧熒光顯微鏡的基本原理以及如何構建三個不同的低成本熒光顯微鏡。這些系統(tǒng)通?；ㄙM數(shù)千美元，但最近有一些努力使它們更容易獲得。我在這里介紹的設計采用智能手機，dSLR和USB顯微鏡。所有這些設計也可用作明場顯微鏡。讓我們開始吧！

第1步：熒光顯微鏡概述

要了解熒光顯微鏡的基本概念，想象一下夜晚的茂密森林，樹木，動物，灌木叢以及其他生活在森林中的森林。如果您將手電筒照射到森林中，您會看到所有這些結構，并且很難想象出特定的動物或植物。假設您只對在森林中看到藍莓灌木感興趣。要做到這一點，你要訓練螢火蟲只被藍莓灌木叢所吸引，這樣當你看著森林時，只有藍莓灌木叢才會亮起來。你可以說你用螢火蟲標記藍莓灌木叢，這樣你就可以看到森林里的藍莓結構。

在這個類比中，森林代表了整個樣本，藍莓灌木代表您想要可視化的結構（例如特定細胞或亞細胞器），螢火蟲是熒光化合物。在沒有螢火蟲的情況下單獨照射手電筒的情況類似于明視場顯微鏡。

下一步是了解熒光化合物（也稱為熒光團）的基本功能。熒光團實際上是小型物體（納米尺度），設計用于連接樣品中的特定結構。它們吸收窄范圍波長的光并重新發(fā)射另一波長的光。例如，一個熒光團可以吸收藍光（即熒光團被藍光激發(fā)），然后重新發(fā)射綠光。通常這通過激發(fā)和發(fā)射光譜來概括（上圖）。這些圖表顯示了熒光團吸收的光的波長和熒光團發(fā)射的光的波長。

顯微鏡設計與普通明場顯微鏡非常相似，有兩個主要差異。首先，照射樣品的光必須是激發(fā)熒光團的波長（對于上面的例子，光是藍色的）。其次，顯微鏡只需要收集發(fā)射光（綠光），同時阻擋藍光。這是因為藍光到處都是，但綠光只來自樣品中的特定結構。為了阻擋藍光，顯微鏡通常會有一種稱為長通濾光片的東西，讓綠光在沒有藍光的情況下通過。每個長通濾波器都具有截止波長。如果光的波長比截止波長，則它可以通過濾波器。因此，名稱，“長途通行證”。更短的波長被阻擋。

第2步：用光學光學建模顯微鏡

這是一個額外的步驟設計顯微鏡的基本原則。沒有必要構建熒光顯微鏡，因此如果您不想深入研究光學，可以跳過它。

明場和熒光顯微鏡都可以使用射線光學器件建模。射線光學的基本前提是光的行為類似于遠離光源傳播的光線。當你環(huán)顧房間時，你會看到窗外的陽光或者燈泡所帶來的光線。然后光被房間中的物體吸收或反射。一些反射光會使它朝向你的眼睛。如果物體被照亮，您可以想象物體上的每個點在所有方向上發(fā)射光線（上圖）。鏡頭，就像我們眼中的鏡頭一樣，將光線聚焦到一點，這樣我們就能看到物體。沒有鏡頭，光線繼續(xù)向外傳播，不會形成圖像。

那么我們如何制作放大小物體的光學系統(tǒng)呢？為了理解設計，你真的只需要知道兩個方程：薄透鏡成像和放大方程：

1/f = 1/si + 1/so

M = -si/so

f是鏡頭的焦距。較短的焦距意味著鏡頭具有更多的聚焦能力。

對象距離也是如此;鏡頭和物體之間的距離（例如樹）。

si是圖像距離;鏡頭與圖像形成位置之間的距離

M是放大率;圖像相對于對象有多大。對于顯微鏡，我們想要增加放大倍數(shù)。

有關薄透鏡方程的完整教程，請查看此Khan Academia視頻。在上面的gif中，您可以看到物體移近鏡頭的距離會增加圖像距離，從而增加放大倍率。帶有兩個箭頭的垂直線表示鏡頭。

宏觀攝影 - dSLR設計1

從這些方程式中，我們可以看到，如果我們使用單鏡頭，然后放大圖像的方式是增加圖像距離。這是通過將鏡頭遠離傳感器移動相機來實現(xiàn)的。許多DIY微距攝影都是通過使用擴管器簡單地移出鏡頭來完成的。這是一個很好的技巧，為昂貴的宏觀透鏡提供了便宜的替代品。要增加放大倍率，您還可以減小鏡頭的焦距。翻轉鏡頭的原因稍微復雜一些，需要了解光學系統(tǒng)的主平面。如果您正在尋找解釋，請告訴我們！

USB顯微鏡

USB顯微鏡以相同的方式工作。它們經(jīng)過專門設計，可以非?？拷R頭拍攝物體。物體越接近鏡頭，放大倍數(shù)越大。它們還有幾個可以移動的鏡頭元件，讓您可以在不同的距離聚焦，類似于變焦鏡頭。除了使用的鏡頭系統(tǒng)，它們與網(wǎng)絡攝像頭非常相似。

智能手機設計

對于智能手機，圖像距離是固定的（即您無法移動鏡頭）。那么我們怎么把它轉換成顯微鏡呢？如果重新排列上面的等式，您會發(fā)現(xiàn)通過縮短鏡頭的焦距可以增加放大倍率：M = si/f -1。打開手機更換相機鏡頭并不是最好的選擇，因此您可以在手機外面添加雙凸透鏡。通過添加另一個鏡頭，可以減少鏡頭系統(tǒng)的有效焦距。我見過人們使用一次性相機鏡頭和激光指示鏡頭。

無限遠校正顯微鏡 - dSLR設計2

我走的最終設計在這個教學中，與實驗室中的顯微鏡設計最為相似。設計中有兩種鏡頭系統(tǒng)：物鏡和鏡筒。物鏡是最接近樣品的組分。將樣品放置在焦平面處，使得物鏡外的光實際上不形成圖像（即，si =無窮大）。圖像由管透鏡形成在傳感器上。該系統(tǒng)的放大倍數(shù)由物鏡和鏡筒焦距的比值給出。以下是有關具有此設計的明場顯微鏡的更多信息的視頻。

步驟3：供應清單

所有設計

耗材

激發(fā)LED：WS2801/WS2811或高功率藍光LED

長通濾波器：Thorlabs，Edmund光學器件，Ealing，昂貴選項：Semrock

幫助保持濾波器

準備好的顯微鏡載玻片

Arduino Nano

按鈕

1kOhm電阻器

4X M3x12螺栓

4X M3螺母

堅固的塑料或蓋玻片

熒光染料（例如熒光筆墨水） ，熒光素，還是這個？）

工具：

適配器的3D打印機

電鉆

熱膠槍

塑料移液器

剪刀

艾倫扳手

LED燈條的烙鐵

1。智能手機設計

智能手機;我使用了我的iPhone 5s

一次性相機鏡頭，激光指示鏡頭或光點鏡頭

智能手機座

2。 USB攝像頭設計

USB顯微鏡

6mm直徑磁鐵

3。 dSLR設計

dSLR;我使用了我的尼康D5000

管鏡頭; 180毫米消色差雙合透鏡

無限校正物鏡

2英寸直徑鏡頭管

安裝到SM2適配器

擋圈

步驟4：構建燈具

熒光顯微鏡的一個關鍵區(qū)別是光源。熒光顯微鏡代替在明視場顯微鏡中使用的白光（即許多波長），需要特定顏色的光（即窄波長范圍）。例如，藍光的波長約為488nm。

我決定用可尋址的LED條構建熒光顯微鏡，以便在熒光和明場成像之間切換。該支架設計用于我在這個教學中展示的所有三種顯微鏡設計。我在Fusion360中設計了它，然后3D打印了三個部分。安裝座向內傾斜LED，以最大化入射到樣品上的光。在gif中，您可以看到它如何與USB顯微鏡集成。對于其他顯微鏡，它只是固定LED。

首先將一個M3螺母添加到黑色LED支架的插槽中，然后滑入M3x12螺栓。螺栓和螺母用作固定螺絲，將USB顯微鏡固定到位。接下來，從W2801或WS2811 LED燈條上切下8個LED，然后將LED推入孔中。將紅色電纜連接到5V，藍色電纜連接到Gnd，白色電纜（數(shù)據(jù)）連接到D2。對于顯微鏡我想循環(huán)幾種顏色，所以我添加了一個連接到D3針的按鈕。附件是運行光源的代碼。

接下來，在灰色LED底座的狹縫中添加四個M3螺母，并將LED組件放在頂部。添加蓋板，滑入M3螺栓，然后用通用扳手擰緊。然后可以將整個組件安裝到具有圓形底部的黑色底座上。

步驟5：準備熒光樣本

也許熒光顯微鏡中最棘手的部分是制作標記樣品。挑戰(zhàn)在于將熒光團僅用于特定結構，這是一個復雜的化學過程。您可以訂購熒光載玻片，就像這些小鼠腎臟載玻片一樣，但它們很貴。校準載玻片也可用，可用于驗證熒光顯微鏡。

要自行制作低成本熒光燈，您需要熒光燈（例如熒光筆液，熒光素等），硬塑料（或蓋玻片），透明膠帶，塑料移液器和吸收溶液的材料。將幾滴熒光溶液添加到想要在圖像中發(fā)光的結構中。在我的例子中，我正在標記一些紗線。將物體放在紙巾上以吸收excel液體。請記住，您不希望熒光液進入樣品中的任何其他物質！

一旦確定標簽物是干燥的，將其添加到蓋玻片上的其余樣品中。我加了一張沒有熒光液的薄紙。您可以使用一塊硬塑料切割成蓋玻片，而不是蓋玻片。用膠帶將樣品貼在蓋玻片上。您現(xiàn)在已準備好對熒光樣品進行成像！請注意，熒光溶液可能會變干并且隨著時間的推移也不會起作用。

我必須制作熒光樣品的另一個想法是將花放入熒光溶液中。熒光溶液將穿過植物的靜脈并標記它們。以下是有關熒光花的更多信息。

步驟6：智能手機熒光顯微鏡

從一次性相機中取出鏡頭，然后使用3D打印機支架將鏡頭滑過智能手機。如果您沒有3D打印機，只需將鏡頭邊緣粘貼到手機上即可。甚至還有專為智能手機顯微鏡設計的更好的鏡頭，您也可以從Smart Micro Optics購買。

通過這種簡單的設置，您手中已經(jīng)擁有了一臺超棒的數(shù)字明場顯微鏡。以下是構建這些類型顯微鏡的更多資源。上面你可以看到我使用一次性相機鏡頭和iPhone5s拍攝的一些照片。如果您想了解其工作原理，請查看步驟3.

現(xiàn)在進入熒光顯微鏡。將智能手機安裝在三腳架上，然后將光源放在智能手機后面。將熒光樣品放在智能手機和光源之間。最后，使用幫助手在樣品和智能手機之間移動過濾器。濾光片將阻擋藍色激發(fā)光。

用這臺顯微鏡拍攝的明場結果確實令人印象深刻，但我對熒光成像感到失望。主要問題是iPhone的自動色彩和曝光校正。如果不控制這些功能，整個框架將變?yōu)樗{綠色，熒光標記的字符串不會彈出。可能有一個解決辦法，因為我發(fā)現(xiàn)了青山衛(wèi)和Aydogan Ozcan的這款智能手機熒光顯微鏡。

步驟7：USB熒光顯微鏡

首先，您需要3D打印過濾器支架。 STL文件如下。所有膠水磁鐵都朝向與過濾器支架相同的方向。然后在與固定LED的安裝座相反的方向上粘貼磁鐵。當這兩個組件都放在LED底座中時，它們將過濾器鎖定到位。將USB顯微鏡滑入LED安裝座并擰緊固定螺釘。您還可以在USB顯微鏡周圍添加畫家的膠帶，以確保緊密貼合。

要在明場和熒光顯微鏡之間切換，請滑動過濾器支架。長通濾波器將位于USB顯微鏡前面，用于熒光成像。然后打開LED燈條，使右側激發(fā)燈亮（可能是藍光）?，F(xiàn)在滑入熒光樣品并保存一些圖像。我使用Mac上的Digital Viewer程序來使用USB顯微鏡。以上是一些例子。我對結果印象非常深刻！

步驟8：DSLR顯微鏡

最終設計提供最高放大倍率和最佳質量，但它是最昂貴。將Fmount-to-SM2適配器添加到dSLR，然后擰入2“和3”管擴展器。然后安裝180毫米消色差雙合透鏡。在物鏡蓋上鉆一個孔，使光可以通過，然后將其推入自定義物鏡到SM2適配器（STL文件在上面）。在鏡筒后添加一個3英寸，2英寸和1.5英寸的擴管器，然后是物鏡。

接下來，您需要將相機牢固地放在桌子上，然后是長通濾鏡，樣品和光源。我在我的CT掃描儀項目中使用了我的dSLR安裝（參見那個instructable的第5步），但你也可以使用三腳架?？梢允褂弥謱⑦^濾器固定到位。將濾光片移開以進行明場成像。上面的前兩個示例圖像是相同的樣本，一個在明場模式，另一個在熒光模式。注意結構的主要區(qū)別！我認為這是熒光顯微鏡有用的最好例子。如果樣本標記良好，您可以將特定結構可視化并將其他所有內容清除。

處理圖像的另一個技巧是簡單地調高對比度。您可以在上面包含明場和熒光圖像的兩幅圖像中看到。

步驟9：顯微鏡比較

以上是熒光和明場成像結果的幾個并列比較。 dSLR設計具有最佳的分辨率，對比度和整體圖像質量，但是最昂貴。我認為USB顯微鏡是使熒光顯微鏡啟動和運行的最佳整體方案。唯一的主要成本是長通濾波器，大約60美元。我仍在尋找更便宜的替代品來降低顯微鏡的總體成本。我對iPhone的結果感到有些失望，但如果我可以手動調整曝光和色彩校正（任何想法？），這個設計可能會有所改進。

USB顯微鏡上的焦點旋鈕也可以使成像成像與dSLR相比，它更容易，這需要精細移動樣品。有高精度線性平臺可用，但我能找到的至少是100美元。我使用卡尺制作了一個廉價線性舞臺的原型，但沒有在這個教學中顯示出來。 MyPhotonics提出了一些由樂高制作的精彩翻譯舞臺設計。我沒有試過它們，但它們看起來像是另一個很好的低成本解決方案。

審核編輯 黃昊宇