目前，可選用的顯微鏡設備和技術(shù)種類很多，本文主要是針對熟悉明場和熒光顯微鏡的讀者。

資料來源：《Live Cell imaging A Laboratory Manual》

作者：Robert D. Goldman，Jason R. Swedlow

01#如何評估一套顯微鏡系統(tǒng)

在選擇使用或購買哪種系統(tǒng)時，第一個要考慮的是哪種參數(shù)對實驗來說是最重要的：速度、靈敏度、分辨率、多波長的識別能力或是細胞的活力，其中的很多參數(shù)之間是互相抵觸的，需要折中考慮。第二個需要考慮的是使用此系統(tǒng)的目的是用于某些特定的檢測，還是用于一般檢測。一般來說，硬件選擇靈活性大的系統(tǒng)更適用于特定檢測，但組裝和使用時有較高的技術(shù)要求。選擇帶有成熟軟件的系統(tǒng)比較節(jié)省時間。無論選擇什么類型的系統(tǒng)，都要先用自己的實驗材料做測試。公司的銷售代表做設備演示時必須根據(jù)實驗使用的熒光染料和要求的放大倍數(shù)選擇合適的濾光片、激發(fā)光源和物鏡。除了感興趣的生物材料外，還應該使用含不同染料的系列玻片，根據(jù)獲得的量化數(shù)據(jù)用于對比不同的系統(tǒng)。

顯微鏡

首先要選擇正置(從上方觀察)還是倒置(從下方觀察)顯微鏡。一般來說，觀察活細胞，要獲得高分辨率的三維圖像時，倒置顯微鏡比較有優(yōu)勢。倒置顯微鏡的載物臺使實驗人員更便于對樣品進行操作，也便于進行顯微注射，并且便于使用環(huán)境可控培養(yǎng)箱。同時，倒置顯微鏡也為CCD相機的安裝提供了更好的機械穩(wěn)定性。

物鏡的選擇

物鏡鏡頭及其使用模式的選擇是影響圖像質(zhì)量的重要參數(shù)。選擇適合封固劑的顯微鏡物鏡對成像來說至關(guān)重要。顯微鏡物鏡可在空氣(通常是低放大倍數(shù))、水浸(WI)或甘油溶液(80%)、硅油或常規(guī)物鏡用油(折射率RI為1.50～1.534)中發(fā)揮作用。物鏡是顯微鏡中最重要的部件，必須定期檢查和清洗。物鏡種類和作用如下：

02#高通量顯微鏡

應用于常規(guī)活細胞成像的大部分基本規(guī)則同樣適用于哺乳動物活細胞的高容量篩選的顯微操作。但是由于高通量的要求，高容量篩選成像系統(tǒng)必須滿足一些額外的必要條件。大量商業(yè)化高容量篩選顯微鏡可供選擇。對于基礎(chǔ)研究環(huán)境的高通量成像系統(tǒng)最好不應只針對于特定的應用，而應該具有彈性化、模塊化，能兼容基于一般熒光顯微鏡的許多其它不同檢測。我們應特別考慮以下特征：

成像硬件的自動化

與樣品制備過程一樣高，高通量成像需高度自動化，包括焦點自動化鑒定，快門控制的光學曝光、馬達控制熒光濾光片組、數(shù)據(jù)存儲以及不同孔(點)之間的顯微鏡載物臺移動。通常固定1~3個位點，其它位點根據(jù)一定的模式由計算機自動計算。基于成像和(或)硬件的自動聚焦一般是高容量篩選顯微鏡系統(tǒng)的瓶頸，因此當購買到一臺高容量篩選儀器時，要特別關(guān)注此特征，尤其是在活體樣品時成像的高容量篩選顯微鏡實驗中，依賴一套恰當?shù)淖詣泳劢箼z測策略對獲得理想的時間分辨率是很重要的。自動聚焦有兩種基本策略。第一是基于軟件的自動對焦，即通過圖像來確定聚焦質(zhì)量(如在不同焦距層中確定最高變異度或優(yōu)化圖像中的聚焦物體數(shù)目)。此技術(shù)的優(yōu)點是直接聚焦在感興趣的結(jié)構(gòu)上，使它們始終保持在焦點，而不管它們到細胞支持物的距離。然而，以圖像為參照的自動聚焦程序通常很慢。在此方法中，在不同的焦平面要獲得多個圖像，而且在聚焦過程中活體樣品曝光量很大，增加了樣品光漂白速度，同時增加了光毒性。第二種策略是基于硬件進行的聚焦點鑒定，即通過近紅外光反射來測量細胞支持物，如蓋波片位置。圖像收集的理想焦距位置可以通過使用者設定對自動檢測出細胞支持物的位置進行抵消，也可以通過額外再加上基于圖像的自動聚焦程序。硬件自動聚焦通常比圖像聚焦鑒定快，顯著降低了光漂白和光毒性。硬件自動聚焦的缺點是需要額外的硬件系統(tǒng)，而且在聚焦過程中只對細胞支持物聚焦。因此在整個實驗過程中，只有樣品位于細胞支持物同一位置時，才能對樣品精確聚焦。硬件自動聚焦很少用于長時間觀察，因為附著細胞經(jīng)常部分解離，或者在有絲分裂過程中圓形化以及胚胎在發(fā)育過程中改變形態(tài)。

穩(wěn)定性

在時程實驗中，成像條件長時間的穩(wěn)定性是定量成像分析的基本條件，只有當成像條件在短時間和長時間都能保持恒定時，在不同時間段內(nèi)進行的實驗才具有可比性，下述顯微鏡部件在高容量篩選顯微鏡實驗中必須優(yōu)化。

激發(fā)光源。對于定量分析，在整個實驗過程中持續(xù)穩(wěn)定的光強度是必要的。這可以通過使用非常穩(wěn)定的光源得以證明，如發(fā)光二極管(LED)或者監(jiān)測和調(diào)整燈溫度和光強度的穩(wěn)定光源。另有一選擇是自動曝光，在不同實驗中可保持成像強度的持續(xù)性。

自動曝光。此特征確保只有幾個飽和像素并使用相機的動態(tài)范圍。在高容量篩選實驗中，重點確定最小和最大曝光時間，并將獲取的灰度值轉(zhuǎn)化為反映樣品的熒光強度可比值?？赏ㄟ^校準選定的最小、最大強度的不同曝光時間和激發(fā)光強度而實現(xiàn)。

馬達驅(qū)動的x-y顯微鏡載物臺。在高容量篩選時程實驗中，載物臺在幾百個位點之間重復移動。為保證每個x-y位點在時間進程中盡可能保持穩(wěn)定以避免成像分析時的問題，應獲得nm級高重復性準確性。

環(huán)境控制。溫度波動可導致焦距漂移，造成可靠性成像困難，也影響細胞中很多生物過程；也就是說，在實驗時間段內(nèi)上下浮動1℃可引起明顯變化。有不同類型的顯微鏡恒溫箱，小型的只控制培養(yǎng)皿，大型的控制整個顯微鏡鏡體。

聚焦穩(wěn)定性。自動聚焦檢測起始后，非常穩(wěn)定的顯微鏡鏡架和恒定溫度足夠保持焦距穩(wěn)定性。如果檢測期間聚焦穩(wěn)定性不夠或者細胞沿z軸方向在細胞支持物上上下移動，可以應用自動調(diào)焦系統(tǒng)來解決這個問題，但會降低時間分辨率、增加細胞毒性和光漂白，這在前面的內(nèi)容中已有討論。

兼容性

高通量篩選顯微鏡實驗需要大量樣本，產(chǎn)生龐大的數(shù)據(jù)組。高通量篩選顯微鏡設置應與樣本制備和數(shù)據(jù)儲存兼容，以便優(yōu)化工作流程，并將獲取的圖像與初始樣本(siRNA/cDNA/化合物)的圖像分析結(jié)果聯(lián)系起來。對于數(shù)據(jù)存儲，常用文件格式不必為圖像處理轉(zhuǎn)變格式、圖像收集過程中自動存入指定文件形式和連接到數(shù)據(jù)庫的可能性都是重要的。

編輯：hfy