圖1 BP-TIDT實驗裝置和雙平面并行檢測光路示意圖

近日，南京理工大學電子工程與光電技術(shù)學院陳錢、左超教授課題組提出了一種新型高速、高分辨率三維無標記顯微鏡技術(shù)。該工作以“High-Speed High-Resolution Transport of Intensity Diffraction Tomography with Bi-Plane Parallel Detection”為題發(fā)表在國際頂尖光學期刊Laser &Photonics Reviews，并當選為期刊封面論文。電光學院博士生周寧和張潤南，碩士生徐偉勝為本文共同第一作者，南京理工大學為第一完成單位和通訊單位。

光學衍射斷層掃描 (ODT) 是一種新興的三維(3D)顯微鏡技術(shù)，利用透明生物樣本的固有折射率 (RI) 作為自然對比機制，實現(xiàn)無標記成像。它能夠以 3D 形式可視化和定量表征此類樣本的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。與傳統(tǒng)熒光成像方法不同，ODT 無需外源熒光染料，避免了光毒性和光漂白等潛在問題。因此，這種非侵入性、無標記的方法已廣泛應(yīng)用于生物物理學、細胞生物學、血液學、微生物學和神經(jīng)科學等各個領(lǐng)域，為研究人員提供了生物醫(yī)學研究和臨床應(yīng)用的有力工具。

基于非對稱照明的非干涉ODT僅需要利用樣品和照明光束之間的相對角度變化在不同條件下捕獲2D強度圖像。隨后使用這些圖像重建標本的3D RI。當照明的數(shù)值孔徑(NA)與物鏡的NA相匹配時，低頻相位分量可以完全轉(zhuǎn)移到強度圖像中。然而，高NA顯微鏡系統(tǒng)在實驗中通常難以嚴格滿足匹配的照明條件，導(dǎo)致在提高ODT的空間分辨率時出現(xiàn)低頻缺失的問題。雖然低頻區(qū)域的相位分量可以通過離焦調(diào)制轉(zhuǎn)移到強度圖像中，但軸向離焦需要在顯微鏡中引入機械運動，限制了它們在生物樣本如活細胞動態(tài)成像中的適用性。因此，在無標記非干涉ODT中獲得高時空分辨率的動態(tài)3D RI重建仍然是一項重大挑戰(zhàn)。

針對上述問題，陳錢、左超研究團隊提出了一種新型的高速、高分辨率非干涉ODT方法 (High-Speed High-Resolution Transport of Intensity Diffraction Tomography with Bi-Plane Parallel Detection，簡稱BP-TIDT)，并搭建了相關(guān)實驗平臺(圖1)。該技術(shù)將雙平面檢測方案與強度傳輸衍射斷層掃描相結(jié)合，在不引入機械位移的情況下補償了低頻下缺失的相位信息，有效地解決了傳統(tǒng)非干涉ODT無法同時實現(xiàn)高時間和空間分辨率的問題。

同時，為了解決傳統(tǒng)迭代求解方法計算時間的消耗，推導(dǎo)了如圖2所示的雙平面?zhèn)鬏敼鈴娧苌鋵游隼碚撃Ｐ?，通過一次反卷積直接求解線性問題，即可得到樣品的3D RI結(jié)果。為了驗證所提出 BP-TIDT 方法的定量 3D RI 重建能力，使用聚苯乙烯微球作為測試樣品進行了實驗，并將結(jié)果與純相微球的模擬進行了比較。實驗結(jié)果與模擬結(jié)果幾乎沒有差異，表明BP-TIDT技術(shù)不需要額外的軸向機械位移就可以有效實現(xiàn)定量RI恢復(fù)，克服了傳統(tǒng)ODT方法在非匹配照明條件下觀察到的重建質(zhì)量下降和RI低估的問題。

圖2.從PTF角度闡述光照條件和離焦相位調(diào)制在非干涉ODT中的重要性，并通過聚苯乙烯微球的仿真和實驗結(jié)果論證BP-TIDT方法的有效性。

圖3展示了BP-TIDT方法與96孔板樣品室兼容性分析，以及高速高分辨率活細胞成像結(jié)果。高通量/高內(nèi)涵成像在生物醫(yī)學研究中至關(guān)重要，可提供詳細的細胞信息和快速的圖像分析。96 孔板作為高通量/高內(nèi)涵成像中常用的樣品室，設(shè)計有小孔徑和深壁，以維持細胞生長所需的營養(yǎng)豐富的環(huán)境，這會限制光入射角度。圖3所示的96 孔板允許的最大照明 NA 為 0.66。當照明 NA 超過此值時，孔壁會阻擋光束，導(dǎo)致圖像信息丟失。本文提出的 BP-TIDT 方法克服了非干涉 ODT 技術(shù)中固有的匹配照明條件，使高 NA 物鏡(例如 40× 0.95 NA)在高通量/高內(nèi)涵成像中的應(yīng)用成為可能，從而顯著提升成像分辨率。

如圖3(c) 所示，BP-TIDT技術(shù)結(jié)合96孔培養(yǎng)皿用于 COS-7 細胞的高速、高分辨率 3D RI成像。該圖像顯示了分裂過程中的 COS-7 細胞，具有兩個細胞核。在細胞分裂期間，細胞兩極的胞吞作用很明顯，這是一個高能量需求的時期。這個過程對于細胞的能量和物質(zhì)攝入調(diào)節(jié)至關(guān)重要。此外，作為細胞的能量來源，線粒體在低能量需求下采用細長的形狀以提高代謝效率，并在細胞分裂期間變得更短更圓以滿足增加的能量需求。研究結(jié)果表明，所提出的方法對藥物篩選和分子生物學研究等應(yīng)用特別有益。該技術(shù)通過更快的速度和更高的分辨率促進對生物樣本的詳細體積分析，加速了科學發(fā)現(xiàn)。

圖3 BP-TIDT方法與96孔板樣品室兼容性分析及成像結(jié)果

上述工作得到了國家重大儀器專項、國家自然科學基金、江蘇省基礎(chǔ)研究計劃前沿引領(lǐng)專項、江蘇省青年基金項目、中央高?？蒲袑ｍ椯Y助項目以及江蘇省光譜成像與智能感知重點實驗室開放基金的支持。

審核編輯 黃宇