共聚焦顯微技術(shù)，作為光學(xué)顯微鏡領(lǐng)域的一項(xiàng)里程碑式創(chuàng)新，為科學(xué)家們提供了一種全新的視角，以前所未有的清晰度觀察微觀世界。美能光子灣3D共聚焦顯微鏡，作為光學(xué)顯微鏡領(lǐng)域的革命性工具，不僅能夠捕捉到傳統(tǒng)寬視野光學(xué)顯微鏡難以觸及的精細(xì)圖像，更以其共聚焦技術(shù)，為我們提供了控制景深、消除背景干擾的先進(jìn)手段，從而顯著提升圖像質(zhì)量。

近年來(lái)，共聚焦顯微鏡的普及度呈爆炸式增長(zhǎng)，部分原因是可以相對(duì)輕松地從為傳統(tǒng)熒光顯微鏡準(zhǔn)備的樣本中獲取極高質(zhì)量的圖像。這項(xiàng)技術(shù)通過精確的光學(xué)切片和高效的光束聚焦，使得科學(xué)家們能夠清晰地觀察和分析樣本、材料和納米結(jié)構(gòu)，從而在半導(dǎo)體技術(shù)、生物學(xué)、材料科學(xué)等領(lǐng)域取得突破性進(jìn)展。

Part.01

共聚焦顯微鏡發(fā)展歷程

共聚焦顯微鏡的基本概念最初由 Marvin Minsky 在 20 世紀(jì) 50 年代中期提出，于 1955 年制造出第一臺(tái)共聚焦掃描顯微鏡，并于 1957 年申請(qǐng)了專利。通過移動(dòng)載物臺(tái)來(lái)實(shí)現(xiàn)焦平面中照明點(diǎn)的掃描。當(dāng)時(shí)他還是哈佛大學(xué)的博士后。Minsky 想要在未染色的腦組織制劑中對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行成像，并希望對(duì)生物系統(tǒng)中發(fā)生的生物事件進(jìn)行成像。Minsky 的發(fā)明在很大程度上沒有引起人們的注意，這很可能是因?yàn)槿狈Τ上袼璧膹?qiáng)光源和處理大量數(shù)據(jù)所需的計(jì)算機(jī)馬力。

來(lái)自 Minsky 專利申請(qǐng)的方案，顯示了他制造的透射共聚焦掃描顯微鏡的原理

繼 Minsky 的工作之后，Mojmir Petran和Milan Hadravsky在 20 世紀(jì) 60 年代末制造了一種多光束共聚焦顯微鏡，該顯微鏡利用旋轉(zhuǎn)（Nipkow）盤來(lái)檢查未染色的腦切片和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。

Petran 串聯(lián)掃描顯微鏡的方案

之后，M. David Egger繼續(xù)在這一領(lǐng)域探索，開發(fā)出第一臺(tái)機(jī)械掃描共聚焦激光顯微鏡，并于 1973 年發(fā)表了第一張可識(shí)別的細(xì)胞圖像。

在 20 世紀(jì) 70 年代末和 80 年代，計(jì)算機(jī)和激光技術(shù)的進(jìn)步，加上數(shù)字圖像處理的新算法，引起了人們對(duì)共聚焦顯微鏡的興趣日益濃厚。荷蘭物理學(xué)家 G. Fred Brakenhoff 于 1979 年開發(fā)了掃描共聚焦顯微鏡，而幾乎與此同時(shí)，Colin Sheppard 也為該技術(shù)做出了貢獻(xiàn)，提出了圖像形成理論。Tony Wilson、Brad Amos 和 John White 培育了這一概念，并在后來(lái)（20 世紀(jì) 80 年代末）展示了共聚焦成像在熒光生物樣本檢查中的實(shí)用性。第一批商用儀器于 1987 年問世。

20 世紀(jì) 90 年代，光學(xué)和電子學(xué)的進(jìn)步帶來(lái)了更穩(wěn)定、更強(qiáng)大的激光器、高效掃描鏡單元、高通量光纖、更好的薄膜介電涂層和具有降低噪聲特性的探測(cè)器。再加上 20 世紀(jì) 90 年代末出現(xiàn)的快速發(fā)展的計(jì)算機(jī)處理速度、增強(qiáng)的顯示技術(shù)和大容量存儲(chǔ)技術(shù)，共聚焦顯微鏡的應(yīng)用數(shù)量呈爆炸式增長(zhǎng)。

顯微鏡歷史時(shí)間線

共聚焦顯微鏡比傳統(tǒng)的寬視野光學(xué)顯微鏡有幾個(gè)優(yōu)勢(shì)，包括能夠控制景深、消除或減少遠(yuǎn)離焦平面的背景信息（這會(huì)導(dǎo)致圖像質(zhì)量下降）以及能夠從厚樣本中收集連續(xù)光學(xué)切片。共聚焦方法的基本關(guān)鍵是使用空間濾波技術(shù)來(lái)消除厚度超過焦平面的樣本中的失焦光或眩光。

Part.02

共聚焦顯微鏡工作原理

在傳統(tǒng)的寬視野落射熒光顯微鏡中，整個(gè)標(biāo)本受到非相干汞或氙弧放電燈的強(qiáng)烈照射，產(chǎn)生的二次熒光發(fā)射圖像可以直接在目鏡中查看，也可以投射到電子陣列檢測(cè)器或傳統(tǒng)膠片平面的表面上。與這個(gè)簡(jiǎn)單的概念相反，共聚焦顯微鏡中的成像機(jī)制根本不同。

光源發(fā)射的探測(cè)光經(jīng)照明針孔，經(jīng)由分光鏡反射至物鏡，并聚焦于焦平面上的樣品上，對(duì)樣品焦平面每一個(gè)點(diǎn)進(jìn)行掃描。樣品中如果有可被激發(fā)的熒光物質(zhì)，受到激發(fā)后發(fā)出的熒光經(jīng)原來(lái)入射光路直接反向回到分光鏡，通過探測(cè)針孔先聚焦，聚焦后的光被光電倍增管（PMT）探測(cè)收集，并將信號(hào)輸送到計(jì)算機(jī)，處理后在計(jì)算機(jī)顯示器上顯示圖像。

在對(duì)比寬視野顯微鏡和共聚焦顯微鏡之間的相似點(diǎn)和不同點(diǎn)時(shí)，比較每種技術(shù)所采用的標(biāo)本照明的特性和幾何形狀通常很有用。傳統(tǒng)的寬視野落射熒光顯微鏡物鏡將寬照明錐聚焦在大量標(biāo)本上，標(biāo)本被均勻且同時(shí)照亮（如下圖左側(cè)所示）。物鏡收集了大部分反射回顯微鏡的熒光發(fā)射（取決于數(shù)值孔徑）并投射到目鏡或檢測(cè)器中。由于發(fā)射的背景光和來(lái)自焦平面上方和下方區(qū)域的自發(fā)熒光，結(jié)果會(huì)產(chǎn)生大量信號(hào)，從而嚴(yán)重降低分辨率和圖像對(duì)比度。

共聚焦顯微鏡中的激光照明源首先擴(kuò)展以填充物鏡后孔徑，然后由透鏡系統(tǒng)聚焦到焦平面上的一個(gè)非常小的光斑（如上圖右側(cè)所示）。照明點(diǎn)的大小范圍為直徑約為 0.25 至 0.8 微米（取決于物鏡數(shù)值孔徑），最亮強(qiáng)度下的深度為 0.5 至 1.5 微米。共聚焦光斑大小由顯微鏡設(shè)計(jì)、入射激光波長(zhǎng)、物鏡特性、掃描單元設(shè)置和標(biāo)本決定。上圖顯示了相同數(shù)值孔徑下寬視野和點(diǎn)掃描共聚焦顯微鏡的典型照明錐體的比較。寬視野顯微鏡可以照亮標(biāo)本大面積的整個(gè)深度，而共聚焦顯微鏡則用以焦平面為中心的精細(xì)聚焦的照明光斑掃描樣品。

現(xiàn)代共聚焦顯微鏡可以看作是一個(gè)完全集成的電子系統(tǒng)，其中光學(xué)顯微鏡在由一個(gè)或多個(gè)電子探測(cè)器、一臺(tái)計(jì)算機(jī)（用于圖像顯示、處理、輸出和存儲(chǔ)）以及多個(gè)激光系統(tǒng)（結(jié)合波長(zhǎng)選擇裝置和光束掃描組件）組成的配置中起著核心作用。在大多數(shù)情況下，各個(gè)組件之間的集成非常徹底，因此整個(gè)共聚焦顯微鏡通常統(tǒng)稱為能夠產(chǎn)生電子圖像的數(shù)字或視頻成像系統(tǒng)。

ME-PT3000

美能光子灣3D共聚焦顯微鏡

美能光子灣3D共聚焦顯微鏡是一款用于對(duì)各種精密器件及材料表面，可應(yīng)對(duì)多樣化測(cè)量場(chǎng)景，能夠快速高效完成亞微米級(jí)形貌和表面粗糙度的精準(zhǔn)測(cè)量任務(wù)，提供值得信賴的高質(zhì)量數(shù)據(jù)。

• 超寬視野范圍，高精細(xì)彩色圖像觀察

• 提供粗糙度、幾何輪廓、結(jié)構(gòu)、頻率、功能等五大分析功能

• 采用針孔共聚焦光學(xué)系統(tǒng)，高穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

提供調(diào)整位置、糾正、濾波、提取四大模塊的數(shù)據(jù)處理功能

共聚焦顯微鏡技術(shù)的發(fā)展，不僅為科研人員提供了一個(gè)強(qiáng)大的研究工具，也為工業(yè)應(yīng)用中的精密制造和質(zhì)量控制提供了新的解決方案。美能光子灣3D共聚焦顯微鏡，以其先進(jìn)的技術(shù)和可靠的性能，正在成為推動(dòng)科學(xué)發(fā)現(xiàn)和技術(shù)創(chuàng)新的關(guān)鍵設(shè)備。隨著技術(shù)的不斷優(yōu)化和應(yīng)用領(lǐng)域的拓展，我們期待共聚焦顯微鏡技術(shù)在未來(lái)能夠揭示更多微觀世界的奧秘，為人類對(duì)自然界的認(rèn)知帶來(lái)革命性的變化。

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